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质粒纯化方案中的关键步骤

如今质粒纯化不再是什么难题，那么做了这么次质粒抽提的你了解质粒纯化的原理吗？你知道哪些步骤对质粒纯化的成功起着关键作用吗？

QIAGEN质粒抽提简单原理：

在碱性条件下裂解**之后，将裂解液以指定的盐浓度加入QIAGEN-tip当中。质粒DNA将发生选择性的结合而从RNA、蛋白质及其他细胞污染物中被分离出来。

1、制备细胞裂解产物

细胞产率很大程度上依赖于细胞裂解质量。因此制备澄清的细胞裂解产物是QIAGEN纯化方案中的重要一环，QIAGEN已经仔细针对优的裂解条件进行了相关的专业设计。

对培养物进行收获和重悬之后，在RNase A存在的条件下使用NaOH-SDS（P2缓冲液）裂解**细胞。SDS溶解了细胞膜中的磷脂和蛋白成分，导致细胞裂解并释放出内容物。NaOH则对染色质和质粒DNA以及蛋白质进行变性。优化的裂解时间能够让细胞中释放出多的质粒DNA，却不会释放出与细胞壁结合的染色体DNA，从而使得质粒暴露于变性条件下的时间达到小。碱性处理的时间过长可能导致质粒DNA形成无法恢复的变性状态。这一状态的质粒在琼脂糖凝胶中移动得更快，并且能够抵抗限制性内切酶的降解。随后通过加入酸性的醋酸钾（P3缓冲液）对裂解液进行中和。高的盐分会导致KDS*发生沉淀，变性蛋白、染色体DNA和细胞碎片随之被盐——去垢剂复合物所俘获。而质粒DNA由于其更小的体积和共价闭合性，得以重新正确地复性并存留于液相之中。由于裂解液中任何残存的SDS都会抑制DNA与QIAGEN树脂的结合，所以裂解液必须缓慢而彻底地进行混合，确保去垢剂完全沉淀。

*十二烷基硫酸钾。

从染色体DNA中分离质粒的原理主要基于细胞壁结合的染色体DNA与盐分、去垢剂和蛋白的不溶复合物之间的共沉淀效应。质粒DNA则仍存留于上方澄清的液相当中。裂解过程中的剧烈处理将会切断**染色体，导致上清液中发生染色体DNA碎片的污染。后续的反应条件将无法在化学上区分质粒DNA与染色体碎片，因此这两种成分将不会被QIAGEN树脂分离，进而在相同的盐浓度下被一同洗脱下来。在实验开始时加入的RNase A能够有效降解碱裂解过程中释放出的RNA成分。随之产生的RNA片段在裂解液所处的盐浓度和pH条件下不会与QIAGEN树脂结合。沉淀物残片通过离心，或QIAfilter Cartridge的使用得以去除，所生成的清亮裂解液可直接载入QIAGEN-tip中。这一阶段中溶菌液的清澈对于保证液相的良好流动性十分重要，终也将保障获得完全去除蛋白质的DNA产物。

2、使用QIAfilter Cartridge澄清**裂解液

QIAfilter Cartridge是一类特殊的过滤装置，专为替代**碱裂解产物的离心步骤而设计。获得培养物沉淀后，**细胞在NaOH-SDS中得以裂解，并添加酸性醋酸钾参与中和，随后直接进入QIAfilter Cartridge中进行孵育。裂解液只需数秒钟便可通过过滤器，随之获得澄清的液相。在中和反应中形成的，包含染色体DNA、盐类、去垢剂和蛋白质的不溶复合物在此过程中被完全出去。QIAfilter Cartridge对于**裂解产物的净化作用相比传统离心法更为有效。此外，通过离心无法净化的小型SDS沉淀也可通过QIAfilter Cartridge完全除去。

3、QIAGEN-tip中DNA的结合和洗涤

清亮裂解液被载入预先平衡好的QIAGEN-tip当中，通过重力流动完成结合反应。裂解液的盐分和pH条件与QIAGEN树脂的选择性一起，确保了质粒DNA结合的特异性，降解后的RNA、细胞蛋白和代谢物则不会发生结合而随液相流出。进一步使用中盐缓冲液（QC缓冲液）洗涤QIAGEN-tip，以去除如痕量RNA和蛋白质（例如RNase A）等任何形式的污染物残留，该过程不会对质粒DNA的结合造成任何影响。QC缓冲液同时也会打断非特异性的相互作用，无需引入苯酚即可去除核酸结合蛋白。洗涤缓冲液中低浓度的酒精会消除非特异性的疏水性相互作用，从而提高所结合DNA的纯度。自此之后，质粒DNA被高盐缓冲液（QF或QN缓冲液）从QIAGEN-tip上有效洗脱下来。

4、通过离心实现脱盐和浓缩

洗脱的质粒DNA通过异丙醇沉淀进行脱盐和浓缩。在室温下进行沉淀反应以大程度地减小盐分的共沉淀效应。在离心之后，使用70%乙醇对DNA沉淀进行洗涤，以去除残留的盐分；同时以更易挥发的乙醇替代异丙醇，是为了方便在后续去除液相。纯化后的DNA经简单的空气干燥步骤和小体积pH8.0的TE缓冲液或pH8.5的Tris•Cl的重新溶解，即可用于转染、测序、标记、克隆，以及任何其他的实验操作。

5、使用QIAprecipitator Module进行脱盐和浓缩

将洗脱得到的质粒DNA与异丙醇进行混合后，使用注射器将其加入试剂盒中的QIAprecipitator Module。该模块能够捕获异丙醇液体混合物中的DNA沉淀。推荐使用乙醇进行额外的洗涤步骤，大程度地提升DNA的纯度。QIAprecipitator得到的DNA沉淀形成了薄层结构，通过使用注射器简单推动，即可使空气流经QIAprecipitator，在去除酒精的同时实现了DNA的充分干燥。之后使用试剂盒的TE缓冲液将DNA从QIAprecipitator洗脱至一个微量离心管中。任何常用的缓冲液或水均可作为替代物进行洗脱。如用纯水洗脱，则DNA应储存于–20°C的温度条件之下，因为DNA在缺乏缓冲系统及螯合剂的条件下会发生降解。这样获得的DNA产物适于进行转染、测序、标记、克隆，以及其他任何的后续应用。

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