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RNA提取技术概述

RT-PCR是将RNA的反转录（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，近年来得到快速发展和广泛应用。首先，经反转录酶的作用，以RNA为模板，合成互补的DNA链（cDNA），再以cDNA为模板，通过PCR扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛。获得的cDNA可用于基因的扩增、克隆，基因表达水平的检测，细胞内RNA病毒的含量等。

A．反转录酶（Reverse Transcriptase，RTase）
自然界中广泛存在着一类以RNA为遗传物质的反转录病毒，其携带的反转录酶是一类以RNA为模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研领域中应用较为广泛的有鸟类成髓细胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）反转录酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反转录酶（M-MLV RT）及其改造重组体M-MLV（RNase H－）。AMV RT具有反转录活性高、适反应温度较高（41～50℃）的特点，可以较好地克服由于模板二级结构造成的逆转录困难问题，然而由于AMV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA复合物中的RNA链，导致合成的cDNA片段偏短，一般为1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性较低，合成的cDNA可达3~4 kb，比较适宜全长cDNA的合成。但M-MLV RT扩增效率较低，适反应温度在37℃左右，故对于具有复杂二级结构的RNA模板逆转录效果。经过定点突变的M-MLV RT（RNase H－），基本上消除了RNase H酶活性，并将酶的适反应温度提高到42℃，大大提高了cDNA链的延伸性和产率，更适于完整基因的获得。我公司的StarScript Reverse Transcriptase（Cat. No. A211）即为经过多重定点突变、具有高扩增能力的RNase H酶活性缺失型M-MLV RT，非常适合用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。

B．模板RNA
反转录反应中作为模板的RNA样品可以是提取的总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。提取RNA的方法多种多样，如单相试剂法（TRIGene，Cat. No. P118；TRIGene LS，Cat. No. P119）、过柱纯化法、磁珠法等。无论使用哪种方法，关键因素是抑制RNA酶活性并大限度地去除基因组DNA污染。

C．引物
用于反转录的引物应视实验的具体情况选择。常用的引物有Oligo(dT)12-18、随机引物(Random Hexamer)和基因特异性引物(Gene-specific primer，GSP)。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种引物都可采用。Oligo (dT)12-18只适用于具有PolyA尾巴的RNA，对无PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不适用。因Oligo (dT)12-18引物需与mRNA的PolyA尾结合，所以对RNA模板的质量要求很高，即使模板有少量降解也会影响全长cDNA的合成量。随机引物适用于任何类型的RNA模板，但由于特异性低，主要用于单一模板的RT-PCR反应。基因特异性引物是根据模板序列设计的互补引物，特异性好，但仅适用于目的序列已知的情况。

D．其它影响因素
反转录反应受多个因素的影响，如Mg2+浓度、引物退火温度、扩增的循环数等。对于具有较高Tm值的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。反转录反应的优化参见“1.7　RT-PCR常见问题及解决方案“部分。

E．一步法和两步法RT-PCR
RT-PCR可以通过一步法或两步法的形式来实现。一步法即将反转录和PCR扩增在同一管内完成，减少加样步骤，有助于减少污染。由于所有的cDNA产物都用于PCR扩增，其灵敏度非常高，尤其适用于检测大量样品和实时定量PCR。两步法将反转录和PCR扩增分开进行，在选择DNA聚合酶（如高保真度、高特异性、长片段等）和引物时具有更大的灵活性。

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