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紫外分析仪检测乳和乳粉中黄曲霉**M1

ICS 67.100.10
X 04
GB/T 18980-2003
乳和乳粉中黄曲霉**M,的测定
**亲和层析净化高效液相色谱法
和荧光光度法
Determination of aflatoxin M1 content in milk and milk powder-
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination by
hig h- pe rformancel iquidc hromatigraphya ndf luorometer
(ISO 14501:1998，IDT)
2003-02-21发布2003-08-01实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局发布
GB/T 18980-2003
前言
本标准的 **亲和层析净化一高效液相色谱法等同采用ISO1 4501;1998《乳和乳粉中黄曲霉**
M **亲和层析净化高效液相色谱法》。
本标准免疫亲和层析净化一荧光光度法快速测定乳和乳粉中黄曲霉**M,o
本标准中的附录A为资料性附录
本标准由北京市质量技术监督局提出。
本标准由食品工业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出人境检验检疫局、国家标准物质研究中心。
本标准主要起草人:王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。
本标准为 **发布。
GB/T 18980-2003
乳和乳粉中黄曲霉**M,的测定
**亲和层析净化高效液相色谱法
和荧光光度法
**亲和层析净化高效液相色谱法
1. 1 范围
本标准适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉**M,含量的测定。
乳粉中的低检测限是。.08 pg/kg，乳中的低检测限是。.008 pg/l
1.2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
1.2. 1
黄曲碑毒索M，含， at7atoxinM ,co ntent
通过本标准所测定出的本物质的质量含量。
注 :黄曲霉**M、的含量以微克/升伽g/L)或微克/千克(fig/kg)表示。
1. 3 原理
试样通过 **亲和柱时，黄曲霉**M 被提取。亲和柱内含有的黄曲霉**M、特异性单克隆
抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉**M,(抗原)键合，形成抗
体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉**M,，收集洗脱
液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉**M,含量
1.4 试荆
除非特别声明，所用试剂为分析纯;使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。
1.4.1 **亲和柱:应该含有黄曲霉**M 的抗体。亲和柱的大容量不小于100 ng黄曲霉**
M,(相当于50 ml浓度为2 pg/l的试样)，当标准溶液含有4 ng黄曲霉**M,(相当于50 mL浓度为
80 ng/l的试样)时回收率不低于80 。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱
至少检查一次(见1.4.1.1和1.4.1.2)
1.4.1.1 柱效检查
用移液管 (1.5.4)移取1.0m 工_的黄曲霉**M,储备液(1.4.5.2)到20m L的锥形试管中
(1.5.9)。用恒流的氮气(1.4.3)将液体慢慢吹干，然后用10 ml. 10%的乙睛(1.4. 2.2)溶解残渣，用力
摇荡。
将该溶液加人到40m L的水中，充分混匀，全部通过**亲和柱。按说明书要求使用**亲和柱。
淋洗**亲和柱后，洗脱下黄曲霉**M,。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定**亲
和柱键合的黄曲霉**M,含量。
计算黄曲霉**M,的回收率，将其结果与1.4.1中所要求的指标进行比较。
1.4.1.2 回收率检查
用移液管 (1.5们移取。.8 m l。005p g/ml的黄曲霉**Ml标准工作液(1.4.5.3)到10m L的
水中，充分混匀，全部通过**亲和柱。按说明书使用**亲和柱。淋洗**亲和柱，洗脱下黄曲霉毒
素M:。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定**亲和柱键合的黄曲霉**M，含量。计
GB/T 18980-2003
算黄曲霉**M，的回收率，将其结果与1.4. 1中所要求的指标进行对比。
1.4.2 乙睛:色谱级
1.4.2.1 25%乙睛一水溶液:将250m L的乙睛(1.4.2)与750m l的水混溶(使用前需要脱气)。
1.4.2.2 10%乙睛一水溶液:将100m L的乙睛(1.4.2)与900m L的水混溶(使用前需要脱气)。
1.4.3 氮气。
1.4.4 三抓甲烷:加人。.5%^-1.0%质量比(与三抓甲烷质量比)的乙醇进行稳定。
1.4.5 黄曲霉**M:标准溶液
1.4.5. 1 校准溶液
黄曲霉毒素M:三抓甲烷溶液标称浓度为10p g/mL。根据下面的方法，在大吸收波段处测定溶
液的吸光度，以确定黄曲霉**M,的实际浓度。
用分光光度计(1.5.11)在340n m^-370n m处测定，扣除三抓甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸
光度值。在接近360 nm大吸收波段A、二处，测得吸光度值为A，根据式(1)计算出浓度值
c, (Pg/mL),
..
‘ = A X M X 1 00 /e · ··· ··· ·· ·· ··· ··· ··· ··· ··· ··· · ··· ·⋯ ⋯ ( 1 )
式中 :
A— 在 3m.:处测得的吸光度值;
M- - 32 8g /mol，黄曲霉**M,摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol);
E- 19 95,溶于三抓甲烷中的黄曲霉**M,的吸光系数，单位为平方米每摩尔(m'/m ol),
1.4.5.2 标准储备液
确定黄曲霉**M;标准溶液的实际浓度值后(1.4.5.)1，继续用三抓甲烷将其稀释至浓度为
0.1 u g/mI一的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个
月。两个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。
1.4.5.3 黄曲霉**M,标准工作液
从冰箱中取出储备液(1.4.5.2)放置至室温，移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液
当天使用当天制备。
黄曲霉毒素M，标准工作液配制:用移液管(1.5. 4) 准确移取1.0 m L的储备液(1.4. 5. 2)到20m L
的锥形试管中(1.5.9)，用和缓的氮气(1.4.3)将溶液吹干，然后用20.0 m L1 0%的乙睛(1.4.2.2)将残
渣重新溶解，30m in内振摇、混匀，配成浓度为。.00 5j g/mI的黄曲霉**M;标准工作液。在用氮气
对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，不能让温度降低太多而出现结露。
在作标准曲线时，黄曲霉**M，的进样量分别为。.05n g,0.1 n g,0.2 n g和。.4 n g。根据高效液
相色谱仪进样环的容积量，用工作液配制一系列适当浓度的黄曲霉**M,标准溶液，稀释液用10%乙
睛(1.4.2.2)
5 仪骼及材料
便用实验室通用仪器设备，特殊仪器及材料说明如下
1,5. 1
1.5.2
1.5.3
1.5.4
1.5.5
1.5.6
1.5.7
1.5.8
1.5.9
1.5. 10
一次性注射器:10 mL和50 mL,
真空系统。
离心机:40 00g 离心力(离心力g=1.12 X 1 0-,X 转/分X旋转半径)。
移液管:1.0m L,2.0 m l和50.0 M L,
玻璃烧杯:250 mLo
容量瓶:100 mLe
水浴
滤纸
:温控30℃士2',50℃士20C,温度范围350C---370C,
带刻度的磨口锥形玻璃试管:5 mL,10 mL,20 mI。
高效液相色谱仪
GB/T 18980-2003
1.5. 10.1 无脉冲泵:适合恒定体积流量约1 mL/min的泵
1.5. 10.2 进样系统:具有固定或可变容积的进样环，进样体积50川--500 pL.
1.5. 10.3 反相色谱柱:填充3 um或者5 km的十八烷基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。
1.5. 10 .4 荧光检测器:具有365n m激发波长、435n m发射波长，在适当的色谱条件下能够测定
0. 02 ng的黄曲霉**M,(相当于5倍噪音)。
1.5. 10.5 记录仪:带打印机或绘图仪、电子积分仪或计算机数据处理系统。
1.5. 1 1 分光光度计:波长范围为200n m--400n m，带光径长度为1c m的石英比色池。
1.5. 12 天平:准确至。.1g，小分度。.01 go
1.6 采样
采样方法不属于本标准叙述的范围，推荐的采样方法请参见ISO7 07[1]a
实验室收到的样品应该具有真正的代表性，在运输和储藏的过程中没有被损坏和改变。
1.7 分析步骤
1.7. 1 概述
所有的操作分析均应尽可能在避光条件下进行。
使用不同厂商的亲和柱，在乳粉的制作、洗涤和洗脱的操作方面可能略有不同，应该严格按照说明
书要求进行操作。通常的分析步骤包括:用水或者盐水缓冲液将乳粉冲制成乳，离心分离后在一定压力
过柱(可能需要预洗)，用水洗柱，并用甲醇或乙睛洗脱吸附在柱上黄曲霉**M,。严格按照规定的流
速进行操作。
1.7.2 制备试样
1.7.2. 1 乳
将乳样品在水浴(1.5 .7) 中加热到350C-370C。用滤纸(1.5.8)过滤(根据情况，也许需要用几张
滤纸进行过滤)，或者在4 000 g离心力下离心15 min。至少收集50 mL乳试样，按照1.7.4继续进行
分析。
1.7.2.2 乳粉
称取 10 g样品(到0.1 g ),置于250m L的烧杯(1.5.5)中。将50m L已预热到50℃的水多次
少量地加人到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。
如果乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴(1.5. 7)中放置至少30m in，仔细混匀。
将溶解的乳粉冷却至20℃后，移人100m l容量瓶(1.5.6 ) 中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一
并移人容量瓶中，再用水定容至刻度。用滤纸(1.5.8)过滤乳，或者在4 000 g离心力下离心15 min,
至少收集50 ml_的乳试样，按照1.7.4继续进行分析。
1.7.3 **亲和柱的准备
将一次性的50m L注射器筒(1.5.1)与亲和柱(1.4.1)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统
(1.5.2)连接起来。
，.7.4 样品的提取与纯化
用移液管移取50m L试样(1.7.2.1或1.7.2.2)到50m L注射器(1.5.1)中，调节真空系统
(1.5.2),控制试样以Zm工一min-3 ML/min稳定的流速过柱。
取下 50 M I的注射器，装上10m L注射器。注射器内加人10M I水，以稳定的流速洗柱，然后，抽
干亲和柱。
脱开真空系统，装上另一个10m L注射器，加人4m L乙睛(1.4.2),缓缓推动注射器栓塞，通过柱
塞控制流速，洗脱黄曲霉**M,，洗脱液收集在锥形管(1.5.9)中，洗脱时间不少于60 s。然后用和缓
的氮气(1.4.3)在30℃下将洗脱液蒸发至体积V。为50 1,L-500 pL(警告:如果蒸发至干，会损失黄曲
霉**M,)。用水将V。稀释10倍至终体积为V,(即500 pL-5 000 VI)。
注:如果注人高效液相色谱仪含黄曲霉**M 的样品，乙睛含量超过10肠，色谱峰变宽。如果水含量超过90%
则对色谱峰的形状没有影响。
cs/T 18980-2003
1.7.5 高效液相色谱分析仪
1. 7.5.1 泵
以t ra定流速将乙睛一水溶液(1.4.2.1)泵流通过高效液相色潜柱。如果需要(根据所用色谱柱的型
号)，调整乙睛一水的比例，以保证使黄曲霉**M,与其他成分的分离效果佳。
乙睛水溶液 (1.4.2.1)的体积流速根据所用色谱柱(1.5. 10 .3 ) 而定对于普通色谱柱(柱长约
25 cm,柱内径约4. 6 mm)而言，流速在1 ml-/min左右，效果好;柱内径为3 mm时，流速在
。.5 mL·min左右，效果好
为了确定佳的色谱条件，好先将不含黄曲霉**M,的阴性样品提取液注人HPLC，然后再注
人样品提取液与黄曲霉**M 标准溶液的混合液
1.7.5.2 色谱性能
标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地注人固定量的黄曲霉**M,
标准溶液，直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%e
黄曲霉毒素M，的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。每隔一段时间测定固
定量的黄曲霉**M，标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。
1.7.5.3 黄曲.毒索M:的标准曲线
根据 HP LC进样环容积，选择适当体积数V,，分别注人含有。.05n g,0.1 n g,0.2n g和0.4 n g的
黄曲霉**M 标准溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉**M,质量数的标准曲线。
1.7.5.4 样品洗脱液的色谱分析及进样方案
通过进样环将适量体积V.洗脱液注人高效液相色谱仪。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出
洗脱液中的黄曲霉**M,。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当连续检测一系列样品
时，建议每隔五个样品，加测一个黄曲霉**M,标准溶液。
根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉**M,的峰高或峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所
含有的黄曲霉**M 质量数(ng).
如果样品洗脱液的黄曲霉**M,的峰面积或峰高值高于标准溶液，用水定容稀释样品洗脱液后，
重新进样分析。
1.8 测定结果的计算与表示
1.8. 1 乳
应用式 ( 2)计算被测样品中的黄曲霉**M,的含量wme
wm = M nX ( V, /V )X ( 1/ V) ··· ··· ··· ···· ··· ···· ··· ···· ⋯ ⋯ (2 )
式中 :
w一下黄曲霉**M的含量，单位为微克每升(Pg/1.);
MA - 一样品洗脱液黄曲霉**M 的峰面积或峰高从标准曲线上得出的黄曲霉**M 的质量
数，单位为纳克 ( ng );
V; 止样品洗脱液的体积数，单位为微升(f4L);
V -一样品洗脱液的终体积数，单位为微升(川_);
V- 一通过免疫亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升(ML)o
计算结果表示到小数点后三位。
1.8.2 叨姗
应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉**M，的含量woo
w。二m X(v/v.)X (1/m) ···························⋯⋯(3)
w=C'l-p- 样品中的黄曲霉**M，的含量，单位为微克每千克((lg/kg);
50 ml样液(7.4)中所含有的乳粉质量数，单位为克(g);
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mn ,V,,vi的含义与1.8.1中所定义的一样。
式( 3)适用于未经稀释的试样，否则应该乘以稀释倍数。
计算结果表示到小数点后三位。
9 精密度
各实验室试验结果的精密度总结于附录A中，这些数据不适用于其他的浓度范围和材质。
10 测试报告
测试报告中应该含有:
a) 描述样品完整特征所需要的所有信息;
b) 采样方法，如果知道请写上;
。) 根据该标准，所采用的试验方法;
d) 该标准没有提出的其他操作细节，对测试结果可能产生影响的操作、现象以及采取的措施
e) 测试结果;
f) 如果检查了重复性，终的验证结果。
2 **亲和层析净化荧光光度法
尽
21 范围
本方法规定了用**亲和层析净化荧光光度法测定乳和乳粉中黄曲霉**M,的条件和详细分析
步骤。
本方法适用于乳和乳粉中黄曲霉**M 的快速测定。乳中黄曲霉**M:的检出限为
0. 1 pg/L，乳粉中黄曲霉**M，的检出限为。.l pg/kgo
22 方法提要
试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过含有黄曲霉**M,特异性单克隆抗体的**亲和层析净
化，黄曲霉**M，交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉**M,具有专一性，当样品通过亲
和柱时，抗体选择性的与所有存在的黄曲霉**M (抗原)键合。用甲醇一水(10+90)将**亲和柱上
杂质除去，以甲醇一水(80+20)通过**亲和柱洗脱，加人澳溶液衍生后的洗脱液于荧光光度计中测定
黄曲霉**M，含量。
23 试剂
除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.3. 1 甲醇(CH,OH):色谱纯。
2.3.2 抓化钠(NaCI),
2. 3. 3 甲醇一水(10+90):取10 mL甲醇加人90 ml_水
2.3 .4 .甲醇一水(80+20):取80m L甲醇加人20m L水。
2.3.5 澳溶液储备液(0.01%):称取适量澳，溶于水后，配成。01%的储备液，避光保存。
2.3.6 嗅溶液工作液(0.00200):取10m L0 .01 %的嗅溶液加人40m l水混匀，于棕色瓶中保存备用
现用现配。
2.3.7 二水硫酸奎宁(C,oH z,N zO z·H2S 04·2H20).
2.3. 8 硫酸溶液(0.05 m ol/L):取2.8m l浓硫酸，缓慢加人适量水中，冷却后定容至10 00m l。
2.3. 9 荧光光度计校准溶液:称取0.34 0g 硫酸奎宁(C2oH 24N 20 2·H2S认·2H20)，用0.05m ol/L
硫酸溶液溶解并定容至100m L，此溶液荧光光度计读数相当于2.0 p g/L黄曲霉**M,标准溶液。
0.05 m ol/I硫酸溶液荧光光度计读数相当于0.0 F ag/l黄曲霉**M-
2.4 仪器
2.4. 1 荧光光度计
2.4. 2 离心机:离心力不低于40 00r /min
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2.4.3 玻璃纤维滤纸:直径11 cm，孔径1.5 pme
2.4.4 黄曲霉**M，**亲和柱。
2.4.5 空气压力泵。
2.4.6 玻璃试管:直径12 mm.长75 mm，无荧光特性。
2.4. 7 玻璃注射器。
2.5 分析步甄
2.5. 1 样品提取
2.5.1.1 乳
取 50 m L乳样品，加人1.0 g 抓化钠，40 00r /min离心力下离心10m in，小心移取用于分析的乳底
层脱脂部分，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。
2.5.1.2 乳粉
称取 5.0 g 乳粉，用30`C^ -60℃水将其慢慢溶解，定容为50m L，加人1.0 g 抓化钠，以下按
2.5.1.1的步骤操作。
2.5.2 净化
将免疫亲和柱连接于10m L玻璃注射器下。准确移取10.0 m L上述滤液注人玻璃注射器中，将空
气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约6 mL/min流速缓慢通过**亲和柱，直至2 mL-3 mL
空气通过柱体。以10 mL甲醉一水(10+90)清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3 mL空气通
过柱体。准确加人1.0 rnL(V,)甲醇一水(80十20)洗脱液洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min，收集全部
甲醉一水洗脱液于玻璃试管中，备用。
2.5.3 测定
2.5.3. 1 荧光光度计校准
在激发波长360n m.发射波长450n m条件下，以。.05m ol/1硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的
读数值为0.0 la g/L;以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为2.0 la g/L,
2.5.3.2 样液测定
取上述洗脱液加人1.0m L(V)0.002%澳溶液，1m in后立即于荧光光度计测定样液中黄曲称**
M，含量c,
2.5.3.3 空白试验
用水代替试样，按2.5 .1^-2.5 .3 步骤做空白试验。
2.6 结.计算
2.6. 1 乳
乳检测结果按式(4)计算:
X,= (c，一Co) XV,X10
V · ·. ······。，·····..·····.··⋯⋯(4)
式中:
X,-一试样中黄曲霉**M，含量，单位为微克每升(pH/L);
cl-— 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉**M:的浓度，单位为微克每升(K4/L);
ca-- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉**M:的浓度，单位为微克每升(KB/L);
V,-— 终净化甲醇一水洗脱液体积，单位为毫升(mL) ;
V--一通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL) ;
10一一仪器的读数系数。
计算结果表示到小数点后一位。
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2.6.2 乳粉
乳粉检测结果按式(5)计算:
X，二
(c2一CO X V, X 10
仇义V ··················。·········⋯ ⋯(5)
式中:
Xz— 试样中黄曲橄**M、含量，单位为微克每千克(Fig/kg);
ci- 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉**M、的浓度，单位为微克每升如g/L;
ca- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉**M,的浓度，单位为微克每升伽g/L);
叭— 终净化甲醉一水洗脱液体积，单位为毫升(mL;
V— 通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL) ;
m- 50 mL试样中所含乳粉的质量数，单位为克每毫升(g/mL) ;
10— 仪器的读数系数。
计算结果表示到小数点后一位。
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附录 A
(资料性附录 )
多个不同实验室的试验结果
世界各地 16个实验室参加了低脂肪(I%)和高脂肪(28 )乳粉样品的协同试验。高脂肪样品是用
于制作参比物质的剩留物[4口，所以黄曲霉**M,的含量是已知的。
对于乳粉，其污染水平为。08p g/kg--0.6 p g/kg，即对于乳而言，污染水平为8n g/L-60n g/I.
试验结果根据ISO 5725-1和ISO 5725-2仁2;3〕规定的统计方法获得，其精密度的数据列于表A.1
(注:试验数据来自于参考文献「5〕和「6]).
表 A .1 箱密度数据
样品编号1 2 3 4 5
实验室个数12 4 l3 11 14
平均值/(ng/kg) 81 150 80 202 580
重复性值。/(ng/kg) 23 60. 1 15 27 203
再现性值R/(ng/kg) 52 98 41 61 310
重复性变异系数/(%) 9. 9 14.0 6. 8 4. 7 12. 5
复验性变异系数/(写) 23 22. 7 18. 3 10.8 19. 1
减少的实验室数是根据Cochran和Grubbs统计方法应该从样本中剔除的数据

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