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专题蛋白质技术的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

[原理]

蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。

聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

[试剂]

1、30%凝胶贮备液：称取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。

2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。

3、10%过硫酸胺（AP）

4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）

5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000ml。

6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)

7、电泳加样缓冲液

10mmol/LpH6.8 Tris

200mmol/LDTT

4%SDS

0.2% 溴酚兰

20% 甘油

8.正丁醇

[器材]

1、移液器

2、移液管

3、烧杯

4、垂直电泳槽

5、电泳仪

[操作步骤]

1.配制分离胶浓度8%、体积15ml

H2O 6.9ml

30%凝胶贮备液 4.0ml

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml

10%SDS 0.15ml

10%过硫酸胺 0.15ml

TEMED 0.01ml

2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

3.聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。

4.配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。

H2O 3.4ml

30%凝胶贮备液 0.83ml

1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml

10%SDS 0.05ml

10%过硫酸胺 0.05ml

TEMED 0.01ml

5.在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。

6.成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。

7.加样

8.电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。

9.取下凝胶，固定、染色或进行Western blot分析。

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