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问题
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可能原因
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验证或解决办法
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背景较高
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封闭不充分
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延长封闭时间，更换合适的封闭剂(脱脂奶粉，BSA,血清等)
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一抗浓度过高
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增加一抗稀释倍数，
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抗体孵育温度过偏高
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建议4℃孵育
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二抗非特异性结合
或与封闭剂交叉反应
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设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
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一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
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在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应.
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洗膜不充分
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增加洗涤次数
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膜不合适
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NC膜比PVDF膜背景低
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膜干燥
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保证充分的反应液，避免出现干膜现象
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没有阳性条带 或很弱
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一抗、二抗等不匹配
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订购试剂时认真选取一抗与组织种属， 一抗与二抗或/和底物与酶 系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测 系统的有效性。
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-抗或/和二抗浓度低
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增加抗体浓度，延长孵育时间
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封闭剂与一抗或二抗有交叉反应
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封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20,或更换封闭剂(常用的 脱脂奶、BSA、血清或明胶
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一抗不识别目的物种的靶蛋白
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检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照
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样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过 低(抗原无效)
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设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔 20-30ug蛋白，样本制备时使用蛋白酶抑制剂，或分级提取目的蛋白。
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转膜不充分，或洗膜过度
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使用丽春红S检测转膜效果，PVDF膜需浸透，需正确的转膜操作，勿 过度洗膜
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过度封闭
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使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少 封闭时间
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一抗失效
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使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现配现用
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二抗受叠氮钠抑制
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所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂)
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酶和底物失效
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直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了、选择在有 效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物.
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曝光时间过短
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延长曝光时间
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多非特异性条 带
或条带位置不 对
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细胞传代次数过多，使其蛋白表 达模式的分化
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使用原始或传代少的细胞株，或平行实验
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体内表达的蛋白样本具有多种修 饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等
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查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小
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蛋白样本降解
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使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
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新蛋白或同族蛋白的分享同种表 位的不同剪接方式
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查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织
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一抗浓度过高
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降低抗体浓度，可以减少非特异性条带
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二抗浓度过高产生非特异性结合
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降低抗体浓度，增加二抗对照
选择特异性更强，只针对重链的二抗
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抗体未纯化
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使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带
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蛋白存在二聚体或多聚体
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SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min,
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